什么是测序技术？

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和转基因技术相比，另外一种分子生物学技术进展神速而且仍在蓬勃发展中，它对我们生活的影响比转基因可大太多了。但同样是因为争议小而默默无闻，那就是测序技术。

测序技术，作为现代生命科学研究中极为关键的一项技术，从诞生之初便不断推动着生物学领域的变革与发展。它的核心使命是测定DNA或RNA分子中碱基（A、T、C、G 或 A、U、C、G）的排列顺序，就如同解开生命遗传密码的钥匙，帮助我们深入洞察生命的奥秘。

第一代测序技术：奠基之作

第一代测序技术中最具代表性的当属桑格测序法（Sanger Sequencing） ，由英国生化学家桑格（Frederick Sanger）和考尔森（Alan R. Coulson）于1977年首次提出。其原理是利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）缺少3’ - OH，无法和脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，导致DNA聚合反应终止的特性。在4个同时进行的反应系统中加入待测序的DNA模板、DNA合成酶、dNTP、引物、缓冲液等，同时按一定比例加入四种少量带有放射性（P32）的ddNTP。引物与模板链结合后，DNA聚合酶将dNTP按碱基互补配对的原理添加到引物后面进行延伸，一旦ddNTP添加到正在合成的DNA链上，反应就会停止 。反应结束后，将这些以特定碱基结尾的片段分4个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过放射自显影片段末端的碱基，反向依次阅读DNA的碱基排列顺序。桑格测序法操作相对简单，测序读数长，结果准确性高，在20世纪90年代初到2010年左右被广泛应用，是基因组测序结果的金标准。不过，它也存在诸多局限，如低通量，一次只能测一个片段，样本起始量要求高，价格相对昂贵，需要大量人力投入，且灵敏度较低。

第二代测序技术：高通量的飞跃

为了实现大规模测序，满足日益增长的研究需求，第二代测序技术应运而生，也被称为新一代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）。其显着特征是高通量、低成本，能够从多个样本中提取大规模并行的高通量数据。这一代测序技术包括454测序技术、Solexa测序技术、SOLiD测序技术等。以Illumina测序技术为例，先将DNA进行片段化处理，通过物理（超声处理）或酶（内切酶）的方法把DNA打碎。在片段的3’端通过A - tailing反应添加一个腺嘌呤碱基形成突出端，使含有单个胸腺嘧啶突出碱基的接头能与DNA片段配对 。接头与固定在纳米孔表面的引物互补，引物起到固定DNA片段两端的作用，形成“桥”。接着通过聚合酶进行桥扩增产生双链桥，将双链分离后得到单链片段簇。加入带有荧光标记的dNTP，聚合酶将其添加到单链上使其延伸，荧光基团会阻止其他dNTP结合。每次dNTP结合到链上时，计算机记录下荧光基团的颜色，然后去除荧光基团继续合成，重复该过程直至获得DNA片段的序列。NGS技术一次运行能够对数以十万计甚至数十亿计的DNA片段进行测序，极大地提高了测序效率。目前，它已广泛应用于从头测序（de - novo sequencing）、重测序、SNP研究、转录组及表达谱分析、转录调控研究（ChIP - seq）等多个领域 ，在肿瘤相关、生殖遗传、感染相关的研究以及临床诊断中发挥着重要作用。

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